近日，廣州醫科大學第一附屬醫院的顧衛麗團隊在《Annals of Translational Medicine》雜志發表了一篇題為“Metabolic signatures of lymphangioleio-myomatosis in biofluids: nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabonomics of blood plasma: a case-control study”的文章，文章基于核磁共振波譜技術（NMR），探討和比較淋巴管平滑肌瘤病（LAM）患者與健康對照組之間血液代謝物的特征和差異，以尋找可用于LAM診斷和分類的生物標志物。核磁共振作為一種新的無創診斷方法，該研究為LAM患者找到潛在標志物做出了有益貢獻。天津市臨床多組學重點實驗室，其依托單位譜天生物與布魯克在核磁共振波譜技術中國推廣達成長期戰略合作。基于核磁共振波譜技術的微量樣本無損檢測、高通量全程自動化、無與倫比的重現性，獨家數據庫平臺等優勢，與廣州醫科大學合作共同完成該項目，在該項目中負責樣本核磁共振檢測和數據分析部分，并列為文章共同作者。
研究背景
淋巴管平滑肌瘤病（LAM）是一種罕見的、低級別的惡性腫瘤，幾乎僅影響女性。有兩種類型：無遺傳背景的散發性LAM（S-LAM）和與遺傳性疾病結節性硬化癥相關的LAM（TSC-LAM）的平均發病率約為4.9/1百萬，TSC在人群中的發病率為≈1/20000，80%的40歲女性TSC患者出現肺部囊性改變，常見的癥狀包括呼吸困難、咳嗽、乳糜積液或氣胸，隨著疾病的進展，肺功能惡化。TSC-LAM還具有TSC的其他多系統臨床特征，包括對神經系統和皮膚的影響。目前，肺或肺外病理診斷是診斷LAM的金標準，但獲取病理標本對患者來說是創傷性的，并有發生氣胸、出血等不良反應的風險。
血清VEGF-D水平可作為區分LAM與其他肺部疾病的非侵入性生物標志物，然而VEGF-D的局限性是，它僅在嚴重淋巴管受累的患者中增加，且仍有許多LAM患者的VEGF-D沒有增加。因此，有必要尋找新的生物標志物，以進一步提高LAM的診斷效果，并有希望區分疾病類型。
核磁共振(NMR)波譜是一種先進的測量方法，可以提供大量的代謝組學數據，包括脂質指標、代謝物和氨基酸。在脂質方面，核磁共振不僅可以根據脂蛋白顆粒大小對不同的脂蛋白進行分組(極低密度脂蛋白(VLDL-1~5)，中密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL-1~6)，高密度脂蛋白(HDL-1~4))，還可以根據物質在磁場中的不同反應，定量測定脂蛋白(膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)、甘油三酯(TG)和磷脂(PL))的含量。在本研究中，我們結合核磁共振波譜和實驗室檢測，比較LAM患者和健康受試者之間以及不同類型的LAM患者之間的血漿脂蛋白和代謝物，尋找差異差異，為LAM的無創診斷和分類提供參考。
研究方法
1. 人群
從2020年1月到2022年1月，連續納入了廣州醫科大學第一附屬醫院門診的69例LAM患者。所有受試者均符合美國胸科學會/日本呼吸學會的標準。診斷主要基于臨床病史、肺高分辨率計算機斷層掃描（CT）（彌漫性薄壁囊性病變）和病理(LAM細胞）的表現。排除標準為：(I)含有其他類型的惡性腫瘤；（II）含有風濕病、內分泌疾病；（III）資料不完整。69例LAM患者中，2例因其他共病被排除（1例乳腺癌，1例甲狀腺機能亢進），67例患者進入下一期研究，其中4例因資料不完整被排除，2例患者拒絕采血。最后，共計61例LAM患者。
2. 分組
51例散發性LAM（S-LAM）、10例結節性硬化癥LAM（TSC-LAM）和30名健康對照組。
3. 樣本收集及運輸
所有受試者禁食10小時后，將靜脈血樣本抽取到真空管中，室溫保存30 min，離心（1200×g，10 min）。血漿樣品在真空管中收集，?80℃干冰運輸。
4. 統計分析
數據采用譜天Umbrella程序進行分析。兩組間數據比較采用Wilcoxon檢驗、獨立樣本t檢驗或χ2檢驗。以P值（<0.05）和Foldchange（FC）（<0.83或>1.2）為篩選標準，尋找差異指標，采用邏輯回歸建模。
研究思路
在S-LAM、TSC-LAM、健康人中，采用Wilcoxon檢驗、獨立樣本t檢驗或χ2檢驗、Logistic建模相關分析，確定差異指標，為LAM的無創診斷和分類提供參考。
研究結果
1. 基本的人口統計學信息和臨床特征
根據美國胸科學會/日本呼吸學會的臨床實踐指南，61例穩定的女性患者符合標準（51例S-LAM，10例TSC-LAM）。所有患者在入組前都完成了肺部的CT掃描。肺CT顯示雙側肺囊腫呈彌漫性分布，符合LAM的特征。診斷后1個月內采集患者采血，抽血時未接受任何治療。患者的年齡、肺功能指標均為正態分布數據，以平均±標準差表示。S-LAM組與TSC-LAM組間的多數臨床指標均無顯著性差異。所有LAM患者和對照組均為亞洲人，其平均年齡為40.70±8.59年（S-LAM患者為40.90±8.68年；TSC-LAM患者為39.70±8.49年）。均無吸煙史，3例（4.92%）有LAM或TSC家族史。61例患者中，44例（72.13%）接受了活檢，28例（45.90%）為氣胸，5例（8.20%）為乳糜胸，39例（63.93%）有肺受累。在受累的肺外器官中，腎性AML所占比例最大（23例，37.70%），其次是肝臟、腹膜后AML、子宮肌瘤和乳糜性腹水。TSC-LAM組肺受累率明顯高于S-LAM組，尤其是腎臟組。作者還在基線時測試了肺功能。肺通氣功能指標包括第一秒用力呼氣量（FEV1）預測%（70.26%±27.50%）、用力肺活量（FVC）預測%（90.63%±16.03%）和FEV1/FVC%（66.93%±23.54%）。一氧化碳肺擴散能力單呼吸%（DLCO-SB%）預測為57.28%±21.63%。
2.LAM患者與健康對照組之間的差異指標
LAM患者與健康對照組之間有15種不同的脂蛋白指標，主要是低密度脂蛋白（LDL）的第五和第六成分，有18種差異代謝產物（均P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。
3.S-LAM患者與健康對照組之間的差異指標
有10種不同的脂蛋白指標，主要是LDL的第六種成分，有18種差異代謝產物（均P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。
4.TSC-LAM患者與健康對照組之間的差異指標
有14種不同的脂蛋白指標，主要是LDL的第六成分，有8種不同的代謝物（均為P<0.05和FC >1.2或<0.83，表2）。
5.S-LAM與TSC-LAM之間的差異指標
S-LAM與TSC-LAM之間有顯著差異的代謝物為肌酐和丙酮（均P<為0.05和FC>為1.2或<為0.83，表2）。兩組間脂蛋白差異無顯著性差異。
6. 選擇LAM患者與健康對照差異的指標進行邏輯回歸分析
將LAM患者與健康對照組比較得到的15個差異脂蛋白指數和18個差異代謝物采用logistic建模。在驗證隊列中，中位數模型的AUC值為0.9737，模型的敏感性和特異性分別為100%和89%。在本組所有受試者中，分別繪制ROC曲線，作為中位數模型中出現的高頻指標或指標，以區分患者和健康人。其中，診斷效果較高的指標為蛋氨酸（AUC =0.929，敏感性=73.8%，特異性=100%，臨界值=0.011 mmol/L）和乙酸（AUC =0.966，敏感性=95.1%，特異性=90%，臨界值=0.006 mmol/L）。
7. 選擇S-LAM患者與健康對照組之間差異顯著的指標進行邏輯回歸分析
將S-LAM患者與健康人的10個差異脂蛋白指標和18個差異代謝物進行邏輯回歸建模。在驗證隊列中，中位數模型的AUC值為0.9852，模型的敏感性和特異性分別為100%和93%。在本組所有受試者中，分別繪制ROC曲線，作為中位數模型中出現的高頻指標或指標，以區分患者與健康人群。其中，診斷效果較高的指標為蛋氨酸(AUC =0.924，敏感性=值72.5%，特異性=值100%，臨界值=值0.011 mmol/L)和醋酸（AUC=值0.963，敏感性=值94.1%，特異性=值90%，臨界值=值0.006 mmol/L）。
8. 選擇TSC-LAM患者與健康對照組之間有顯著性差異的指標進行邏輯回歸分析
將TSC-LAM患者與健康對照組比較得到的14個差異脂蛋白指數和8個差異代謝物，采用邏輯回歸建模。在驗證隊列中，中位數模型的AUC值為1，模型的敏感性和特異性分別為100%和100%。在本組所有受試者中，分別繪制ROC曲線，作為中位數模型中出現的高頻指標或指標，以區分患者和健康人。其中，診斷效果較高的指標為蛋氨酸（AUC =0.948，敏感性=80%，特異性=100%，臨界值=0.011 mmol/L）、乙酸（AUC =0.975，敏感性=100%，特異性=90%，臨界值=0.007 mmol/L）和肌酐(AUC =0.917，敏感性=80%，特異性=95%，臨界值=0.059 mmol/L）。
9. 差異代謝物與臨床指標的相關性分析
收集61例LAM患者的臨床指標，包括年齡、肺功能（FEV1%、FVC%、FEV1/FVC、DLCO-SB%）、氣胸、乳糜胸、腎AML、肝病變、乳糜腹水、子宮肌瘤和腹膜后AML。分析臨床指標與診斷效率高的差異指標（丙氨酸、蛋氨酸、L6TG、醋酸、L6PL、肌酐、組氨酸、2-氨基丁酸、丙酮、肌氨酸）的相關性。蛋氨酸與氣胸的發生顯著相關（P<0.05），肌酐與子宮肌瘤顯著相關（P<0.05）（圖5）
討論
這是首次使用核磁共振方法對亞洲人群中的LAM患者進行代謝組學分析。本研究是為了尋找LAM的血液生物標志物，并評估這種無創檢查的有效性。研究發現，與健康對照組相比，S-LAM和TSC-LAM患者共同顯示部分LDL第六成分表達上調。作者還發現了一些氨基酸的代謝異常，如蛋氨酸和丙氨酸下調，乙酸和肌酐上調。這些指標是高頻指標或中位數模型中同時出現的三種模型中的指標。此外，研究人員還發現，S-LAM和TSC-LAM亞組之間的肌酐和丙酮存在顯著差異。蛋氨酸水平在LAM患者中顯著低于健康人。蛋氨酸是維持細胞生長和蛋白質翻譯所必需的氨基酸。在許多腫瘤中都觀察到蛋氨酸代謝異常（下調），如神經膠質瘤和肺癌。在LAM患者和兩種LAM亞型（S-LAM和TSC-LAM）中，蛋氨酸顯著下降，這表明肺囊性變性可能與蛋氨酸的下調有關。且蛋氨酸可以有效地區分LAM與健康人群，AUC值為0.929，臨界值為0.011 mmol/L。蛋氨酸與氣胸的發生顯著相關，提示患者血液中蛋氨酸水平較低，可能是早期預測氣胸風險的一個指標。在未來，還需要深入的研究來證實這種可能性。另一個診斷效果較高的指標是乙酸。與健康對照組相比，LAM患者的其表達顯著上調。AUC值為0.966（敏感性=95.1%，特異性=90%），臨界值為0.006 mmol/L。先前的一項研究發現，在他們對乳腺癌患者進行的代謝組學分析中，與健康對照組相比，乙酸水平升高，使其成為一種潛在的生物標志物。乙酸在肺癌和肝癌中顯著升高，這證實了乙酸及其代謝物可能有促進腫瘤生長的作用。
此外，作者還發現丙氨酸有差異表達。與健康對照組相比，癌癥患者血漿中的丙氨酸水平顯著降低，這很可能是由于作為主要的糖異生前體，以滿足腫瘤細胞的高糖攝取和需求。胰腺癌細胞依賴細胞外丙氨酸作為碳源，以谷氨酸-丙酮轉氨酶2（GPT2）依賴的方式促進三羧酸循環。最近的一項研究重新確定了丙氨酸在T細胞激活中的作用。GPT2負責丙氨酸分解代謝，將丙氨酸轉化為丙酮酸，丙酮酸是線粒體代謝的主要底物。丙酮酸可以通過補充三羧酸循環來補償谷氨酰胺的消耗，并通過利用不同的酶（如丙酮酸脫氫酶復合物或丙酮酸羧化酶）的活性來維持癌癥的合成代謝過程。在本研究中，丙酮在S-LAM患者中明顯高于健康對照組，并能夠區分S-LAM和TSC-LAM。先前的一項研究發現，肺癌細胞產生的丙酮含量更高，小細胞肺癌患者血液中的丙酮含量顯著升高。酮體主要負責向細胞傳遞能量，并參與調節各種細胞過程。癌細胞中生酮作用的增加可能是由于脂肪生成、糖異生和膽固醇生成的改變，所有這些機制都與酮體調節密切相關，或由于兩者之間對初級能量化合物的高度競爭癌變和健康的細胞。本研究還發現肌酐上調。48-80%的TSC患者患有腎臟疾病，并伴有AML、囊腫、癌癥和/或進展為腎功能不全。
本研究中，TSC-LAM組的AML受累率高達90%，與肌酐升高的結果一致。先前的研究顯示，34-80%的TSC-LAM患者，伴有AMLs、皮質囊腫、惡性病變和/或慢性腎功能不全。與健康對照組相比，肌酐明顯高于TSC-TSC患者，這反映了TSC-LAM患者腎臟受累的可能性。此外，該指標在S-LAM和TSC-LAM之間存在差異表達，顯示出有望作為區分這兩種亞型的指標。作者分析了LAM患者的血漿血脂代謝譜，并與健康對照組進行比較，S-LAM患者的血漿LDL-6甘油三酯顯著升高，而TSC-LAM患者的LDL-6磷脂顯著升高。先前的研究表明，乳腺癌與脂質紊亂相關，血液中低密度脂蛋白水平的升高可能與腫瘤脂質重編程代謝有關，與本研究結果一致。利用核磁共振平臺對升高的脂蛋白亞組進行了分類，發現LDL的第六成分升高，這在常規臨床脂質檢測中通常被忽略。許多研究發現，低密度脂蛋白可促進乳腺癌細胞的增殖、轉移和血管生成。這些代謝物及其在細胞存活和信號轉導中的潛在生物學作用之間的關聯表明，脂質可能既是疾病相關的生物標志物，也是LAM的潛在治療靶點。綜上所述，實驗數據與之前對其他類型腫瘤的報道一致，表明LAM中LDL顯著升高但LDL-6甘油三酯和LDL-6磷脂的AUC不高。脂蛋白異常與LAM發生之間的確切機制尚不清楚，有待于未來更多的基礎研究進一步探索。
由于LAM是一種罕見的疾病，本研究納入的研究對象數量有限，特別是TSC-LAM是一種罕見的罕見疾病，因此病例數量非常少。作者希望在未來能夠擴大患者的數量和多中心的研究來克服這一限制。此外，雖然LAM患者和健康對照組之間的一些脂蛋白和代謝物存在顯著差異，但其潛在機制尚不清楚。未來，對動物模型或細胞模型的研究可以進一步證實其代謝途徑等相關機制，并在治療藥物方面取得突破。
小結
在本研究中，首次通過核磁共振技術深入探討了LAM患者的血液代謝特征。核磁共振對血液樣本具有良好的鑒別能力，從而為LAM的無創診斷方法開辟了新的可能性。代謝紊亂是LAM的表現之一。LAM患者血漿中的蛋氨酸和乙酸水平可作為疾病診斷的生物標志物。蛋氨酸也被發現與LAM患者的氣胸相關。丙酮和肌酐是區分S-LAM和TSC-LAM的很有前途的代謝標志物。
