體液樣本中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證，是實(shí)現(xiàn)疾病精準(zhǔn)診斷與治療，了解疾病發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)及探究其潛在作用機(jī)制等的重要手段，本文以神經(jīng)退行性疾病為例，整理了當(dāng)前可用于體液蛋白質(zhì)組檢測技術(shù)，主要包括基于質(zhì)譜和免疫分析兩大類。
01 基于質(zhì)譜的分析方法
Label-free質(zhì)譜檢測
Label-free質(zhì)譜檢測（LF-MS）采用“自下而上”的分析策略對多種體液或組織樣本進(jìn)行非靶向蛋白含量分析。該方法以肽為中心，首先進(jìn)行蛋白酶解消化產(chǎn)生肽段，然后在肽水平上進(jìn)行蛋白質(zhì)推導(dǎo)，獲得累積信號(hào)對蛋白進(jìn)行定量。不需要化學(xué)標(biāo)簽或內(nèi)標(biāo)，通常用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究。可在多種質(zhì)譜平臺(tái)上開展，如電噴霧電離和高精度質(zhì)量分析儀，包括軌道阱、四級桿和飛行時(shí)間。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)采集模式包括DDA和DIA。
靶向定量質(zhì)譜檢測
主要包括多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）
MRM：低分辨率的三重四級桿（QQQ）質(zhì)譜儀
PRM：高分辨率質(zhì)量分析儀，如四級桿-Orbitrap或Q-TOF系統(tǒng)
通過在樣本中添加同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)/肽，同時(shí)監(jiān)測內(nèi)源肽和同位素標(biāo)記肽，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的定量檢測。因此開展靶向MS前需提前確定目標(biāo)蛋白質(zhì)及其特異性肽段，以創(chuàng)建特定的靶向方法。
技術(shù)特點(diǎn)
MS檢測不依賴于抗體，鑒定蛋白范圍廣泛、高特異性。但技術(shù)復(fù)雜，需專業(yè)人員及實(shí)驗(yàn)室提供專用設(shè)備和儀器。
LF-MS及其生物分析流程可無偏倚的鑒定特定疾病狀態(tài)下的蛋白譜，可用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。
優(yōu)勢：實(shí)驗(yàn)設(shè)置簡單，無需標(biāo)記和后續(xù)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，適用于多種樣本類型（細(xì)胞培養(yǎng)物、生物液體、組織提取物等）。
劣勢：重現(xiàn)性差，尤其在使用DDA方法時(shí)，變異系數(shù)在15%-20%之間，缺失值比例大。通量小，差異表達(dá)分析不如基于標(biāo)記的方法準(zhǔn)確。
MRM-MS/PRM-MS可以用于隊(duì)列驗(yàn)證，并以更高的靈敏度及可重復(fù)方式檢測、定量低豐度蛋白。
PRM可以回顧性的選擇用于定量的相關(guān)離子對，無需在分析前進(jìn)行選擇，特異性高。
發(fā)展前景
研究顯示在發(fā)現(xiàn)一些針對阿爾茲海默癥（AD）的關(guān)鍵血液生物標(biāo)志物（如淀粉樣蛋白和 tau 蛋白）方面，定量靶向 MS 方法優(yōu)于免疫檢測。因此，質(zhì)譜應(yīng)用于臨床具有一定的前景，但在技術(shù)和成本方面需進(jìn)行重大改進(jìn)，使之與常規(guī)應(yīng)用兼容。利用 MS 的高效并行性能來量化一組生物標(biāo)志物，結(jié)合不同生物標(biāo)志物建立有效且可靠的算法，例如神經(jīng)退行性變、神經(jīng)炎癥、突觸功能和共病理等，也非常值得期待。
02 基于抗體的檢測方法
基于鄰位延伸分析的蛋白質(zhì)組學(xué)
鄰位延伸陣列 (PEA) 技術(shù)是一種基于多重抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，目前可檢測超過 3000 種蛋白質(zhì)。它結(jié)合了基于抗體和 DNA 的方法來測量不同體液（例如血液和腦脊液）樣本中的蛋白質(zhì)水平。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：同時(shí)檢測數(shù)千種蛋白，檢測靈敏度高，僅需微量樣本。
劣勢：蛋白選擇具有偏倚，可能高估與抗體結(jié)合能力較好的蛋白而低估沒有抗體或與抗體結(jié)合能力較弱的蛋白。大多數(shù)檢測 panel 只能提供蛋白濃度的相對定量，導(dǎo)致無法直接比較同一批次的不同蛋白，或不同批次的相同蛋白。
發(fā)展前景
隨著新型蛋白的鑒定及高特異性抗體的開發(fā)，PEA 的檢測范圍可進(jìn)一步擴(kuò)展。可開展針對特定疾病的定制產(chǎn)品，包括用于絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品。隨著 PEA 在越來越多研究中的應(yīng)用，跨疾病的 meta 分析將變得重要，為了更深入的探索蛋白質(zhì)組，已開展結(jié)合 PEA、Somascan 和 MS 的多平臺(tái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
基于微球的多重蛋白質(zhì)組學(xué)分析
基于微球的微陣列技術(shù)利用抗體結(jié)合的多重分析方法，實(shí)現(xiàn)高通量多重蛋白質(zhì)分析。將高度特異的捕獲抗體固定在熒光編碼的磁性微球表面，混合后形成懸浮微球陣列，在微孔板中同時(shí)進(jìn)行多種蛋白的定性定量分析。已建立的用于腦脊液和血漿的分析方法中，能夠平行分析 384 個(gè)樣本中的 384 靶標(biāo)蛋白。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：高通量，多個(gè)目標(biāo)蛋白并行分析，樣本消耗少，制備和工作流程簡單，相對較高的靈敏度和特異性。檢測限范圍通常在 pg/mL 到 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線可在單個(gè)分析中形成，進(jìn)而開展絕對定量評估，并隨著時(shí)間的累積形成標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)集。不同磁珠在一定程度上可自由組合，針對特定研究領(lǐng)域定制蛋白檢測 panel。還可以使用相同的試劑從多重探索性研究轉(zhuǎn)換為針對性的驗(yàn)證性研究。
劣勢：不適合大范圍研究（不能包含所有蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線），成本高，需要進(jìn)行生物學(xué)和技術(shù)重現(xiàn)性驗(yàn)證。
發(fā)展前景
隨著抗體增加，進(jìn)一步擴(kuò)大檢測和應(yīng)用范圍。通過開發(fā)新的檢測技術(shù)（如光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫法），可以提高檢測靈敏度和并行檢測性能。
酶聯(lián)免疫吸附測定
酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA ）是一種基于抗體檢測液體基質(zhì)中的痕量蛋白質(zhì)的技術(shù)。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：對腦脊液樣本中神經(jīng)痕量蛋白檢測具有較高的靈敏度。
劣勢：對血液樣本靈敏度較差，優(yōu)化適合 ELISA 的抗體往往需要較長時(shí)間。
發(fā)展前景
ELISA 在臨床診斷中占主導(dǎo)地位，但體外診斷行業(yè)的未來在于免疫分析數(shù)字化及多重化。
化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光
化學(xué)發(fā)光（CLIA）和電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ELC）都是基于封閉抗體系統(tǒng)的檢測，通過磁珠偶聯(lián)的生物素-鏈霉親和素捕獲免疫復(fù)合物，分析反應(yīng)的指示劑是發(fā)光。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：相較比色法（如ELISA），對分析反應(yīng)進(jìn)行絕對定量，動(dòng)態(tài)范圍大，具有高靈敏度和特異性。
劣勢：成本高，分析物檢測和測試panel的可用性有限，分析系統(tǒng)封閉。
發(fā)展前景
CLIA 顯示出用于多重免疫測定的巨大潛力，這種測定在臨床應(yīng)用中越來越受歡迎。隨著這些技術(shù)的發(fā)展，新型生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的速度將會(huì)加快。
Simoa
Simoa 是一種基于磁珠的 ELISA，可在 Quanterix HD-X/HD-1 全自動(dòng)分析儀或 SR-X 分析儀上運(yùn)行。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：靈敏度高，較 ELISA 高 1000 倍以上，檢測下限達(dá)到 fg/mL 級別，實(shí)現(xiàn)超低豐度蛋白的有效檢測和定量。通量高，多重檢測能力，可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行方案開發(fā)和優(yōu)化。
劣勢：儀器及試劑耗材成本高，需要專業(yè)人員保證平臺(tái)的正確操作和維護(hù)。
發(fā)展前景
研究顯示，通過提高磁珠讀取效率可進(jìn)一步優(yōu)化 Simoa，改進(jìn)后允許檢測低至亞原子濃度的蛋白質(zhì)，這種靈敏度可能會(huì)為新基質(zhì)中生物標(biāo)志物的檢測打開一扇機(jī)會(huì)之窗。
微流控免疫分析
ProteinSimple 全自動(dòng)微流控免疫分析儀提供了微流控免疫分析（ELLA）平臺(tái)，將特異性捕獲抗體包被在微流體玻璃反應(yīng)管（GNR）中，再將三個(gè) GNR 嵌入全自動(dòng)微流體免疫檢測管。目標(biāo)分析物與捕獲抗體結(jié)合，在檢測抗體作用下，每個(gè)樣本會(huì)自動(dòng)輸出 3 個(gè)平行 GNR 的數(shù)據(jù)和均值。濃度通過使用已校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線生成，該系統(tǒng)可用于單一和多重檢測。
技術(shù)特點(diǎn)
優(yōu)勢：ELLA 是一款小型臺(tái)式機(jī)器，操作簡便，通量高，提供開放式墨盒版本，允許客戶按照需求設(shè)置檢測。
劣勢：成本高，對于 Nfl 或細(xì)胞因子的靈敏度不及 Simoa。
發(fā)展前景
小型且易于使用的臺(tái)式 ELLA 平臺(tái)可用于臨床低豐度生物標(biāo)志物的常規(guī)檢測，還可用于急診或重癥監(jiān)護(hù)病房中的即時(shí)監(jiān)測。
蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用
盡管蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果更加直接，但轉(zhuǎn)錄組分析在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域也有一些重要應(yīng)用。健康個(gè)體與患者之間蛋白質(zhì)豐度差異可能有多種原因：1.蛋白豐度直接影響疾病，例如蛋白不降解、磷酸化或聚集在一起；2.疾病可能引起基因調(diào)控改變進(jìn)而影響蛋白水平。后者可以通過RNA-seq進(jìn)行分析，因此蛋白和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析可以提供更多的信息從而揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制。
【參考文獻(xiàn)】Teunissen CE, Kimble L, Bayoumy S, et al. Methods to Discover and Validate Biofluid-Based Biomarkers in Neurodegenerative Dementias. Mol Cell Proteomics. 2023 Oct;22(10):100629.
